本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中小鼠Ⅴ型膠原(COL5)的含量。 有效期：6個月 保存條件：2-8℃ 小鼠Ⅴ型膠原(COL5)試劑盒組成： 
備注： 1. (96T/48T)打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全。 2. 標準品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL 3. 經(jīng)過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗。 檢測前準備工作： 1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 2.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象；放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)晶溶解后再配置洗滌液。可將20ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃ 3.20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。 實驗原理： 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被小鼠Ⅴ型膠原(COL5)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的小鼠Ⅴ型膠原(COL5)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃度。 實驗所需自備試驗器材： 1.酶標儀(450nm) 2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒溫箱 4.蒸餾水或去離子水 樣本處理及要求： 1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果)，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。 4.細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。 6.樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。 7.樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃(6個月內(nèi)檢測)，避免反復(fù)凍融，標本溶血會影響后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。 注意事項： 1.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。 2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。 3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。 4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。 5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。 6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。 7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。 8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。 9.不能使用過期產(chǎn)品。 10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。 小鼠Ⅴ型膠原(COL5)試劑盒操作步驟： 1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。 2．設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。 3．樣本孔中a加入待測樣本50μL；空白孔不加。 4．除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。 5．棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350μL)，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板)。 6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。 7．每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。 實驗結(jié)果計算： 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。 
(此圖僅供參考)
性能： 1. 檢測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。 2.靈敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。 3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。 4.重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。 技術(shù)小提示： 1.當(dāng)混合或重溶蛋白溶液時，盡量避免起沫。 2.為了避免交叉感染，配置不同濃度標準品、上樣、加不同試劑都需要更換槍頭。另外不同試劑請分別使用不同的移液槽。 3.每次孵育時，請正確使用封板膠可保證結(jié)果的準確性。 4.混合后的顯色底物在上板前應(yīng)為無色，請避光保存；假如微孔板后，將由物色變成不同深度的藍色。 5.終止液上板順序應(yīng)同顯色底物上板順序一致；加入終止液后，孔內(nèi)顏色由藍變黃；若孔內(nèi)有綠色，則表明孔內(nèi)液體未混勻；請充分混合。 說明： 1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。 2.終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準備充足的標本備份。 3.不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。 4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到佳的檢測結(jié)果。
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